У процесу спровођења генетских студија често се сусрећемо са недовољним узорцима РНК, на пример, за проучавање сићушних анатомских оралних тумора, чак и једноћелијских узорака, и узорака специфичних генских мутација које се транскрибују на веома ниским нивоима у људским ћелијама.Наравно, за Цовид-19 тест, ако брисеви нису на правом месту или недовољно пута током узорковања, величина узорка ће бити веома мала, због чега је Комисија за здравље и планирање породице пре два дана изашла и прошао тест, а ако узорковалац нуклеинске киселине није узео шест узорака, можете то пријавити.
Осетљивост реагенса је важна јер имамо овај или онај проблем, па шта можемо да урадимо да побољшамо осетљивост РТ-ПЦР?
Пре него што разговарамо о могућим решењима, да поменемо две велике компликације са ситуацијом коју смо управо споменули.
Пре свега, бринемо о губитку РНК када имамо само неколико популација ћелија у нашем узорку.Ако се користе традиционалне методе одвајања и чишћења, као што је метода колоне или метода преципитације нуклеинске киселине, постоји велика могућност да ће неколико узорака бити изгубљено.Једно решење је додавање молекула носача, као што је тРНА, али чак ни тада нема гаранције да је наш експеримент опоравка у реду.
Дакле, који је бољи начин?Добра опција за култивисане ћелије или микроанатомске узорке је употреба директне лизе.
Идеја је да се ћелије раздвоје на 5 минута, пустите РНК у раствор, затим зауставите реакцију на 2 минута, затим додате лизат директно у реакцију реверзне транскрипције тако да се РНК не изгуби, и на крају директно ставите резултујућу цДНК у реакцију у реалном времену.
Али шта ако, због ограничене почетне тачке или мале количине експресије циљног гена, можемо да рециклирамо сву РНК и још увек не обезбедимо довољно шаблона да бисмо добили добар сигнал у реалном времену?
У овом случају, корак пре-амплификације може бити веома користан.
Следи шема за повећање осетљивости након реверзне транскрипције.Пре него што почнемо, морамо да питамо низводно које мете нас занимају, како бисмо дизајнирали специфичне прајмере за ове мете за пре-амплификацију.
Ово се може постићи стварањем мешаног прајмера са до 100 парова прајмера и реакционим циклусом од 10 до 14 пута.Према томе, Мастер Мик посебно дизајниран за овај захтев је потребан за пре-амплификацију добијене цДНК.
Разлог за постављање броја циклуса између 10 и 14 је тај што овај ограничени број циклуса обезбеђује случајност између различитих циљева, што је кључно за истраживаче којима су потребне квантитативне молекуларне информације.
Након пре-амплификације, можемо добити велику количину цДНК, тако да је осетљивост детекције на полеђини знатно побољшана, а можемо чак и да разблажимо узорак и изведемо више ПЦР реакција у реалном времену како бисмо елиминисали могуће случајне грешке.
Време поста: Апр-11-2023